Infecciones Víricas e Inmunidad en Individuos Inmunosuprimidos
La infección por citomegalovirus (CMV) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en individuos con un sistema inmune inmaduro o disfuncional como los receptores de órgano sólido o los recién nacidos.CMV es capaz de infectar a un gran número de células en el cuerpo humano incluyendo fibroblastos, células mieloides, monocitos, macrófagos y células epiteliales, entre otras. La entrada del virus en las distintas células se produce por la interacción de diversos complejos virales con sus respectivos receptores celulares y estas proteínas virales encargadas de reconocer a la célula eucariota son distintos en función del tipo celular. El epitelio, es la primera barrera natural y diana del virus en el cuerpo humano y su entrada es la que requiere de un número mayor de proteínas virales.
A pesar del esfuerzo realizado en los últimos años en el desarrollo de tratamientos y vacunas, a día de hoy no ha sido comercializada ninguna vacuna frente a CMV por lo que el desarrollo de la misma es un objetivo prioritario a nivel mundial. En este sentido, recientemente en el grupo hemos descrito y publicado por primera vez la producción de cuerpos densos en células epiteliales, las cuales son la diana principal del virus en el cuerpo. Los cuerpos densos son agregados de proteínas del virus recubiertos por una membrana en la cual se encuentran embebidos distintos antígenos virales. La gran cantidad de proteínas junto con la ausencia de ácido nucleico y por tanto de infectividad, hace de estas estructuras candidatos ideales a ser usados como vacunas. Anteriormente, los cuerpos densos aislados de fibroblastos han sido estudiados como candidatos vacunales frente a CMV, sin embargo, los resultados obtenidos no fueron todo lo buenos que se esperaba. Debido al amplio tropismo del virus, puede que estos cuerpos densos producidos en fibroblastos carecieran de algunas proteínas clave para la activación de la respuesta inmune que potencialmente pudieran estar en los cuerpos densos producidos en epitelio.
Objetivos:
El objetivo de este trabajo es la optimización y aislamiento de cuerpos densos producidos en células epiteliales ARPE-19 infectadas por CMV, así como su caracterización proteómica y análisis de la respuesta inmune inducida en ratones tras la inyección de los mismos.
Principales técnicas que se utilizarán:
Para llevar a cabo el trabajo el alumno manejará diversas técnicas de Virología básica, Biología celular, Microscopía y Biología molecular.
En primer lugar, se realizarán infecciones tanto en epitelio (ARPE-19) como en fibroblastos (MRC-5), a modo de control, para aislar de las mismas los cuerpos densos mediante gradientes de densidad usando iodixanol. Una vez se hayan purificado en suficiente cantidad en ambas líneas celulares se comprobará su pureza mediante tinción negativa y visualización por microscopía electrónica.
Posteriormente se realizará su caracterización proteómica mediante dos sistemas, SWATH y Western Blot (WB). Mediante WB usando anticuerpos monoclonales frente a las proteínas del virus más conocidas con el fin de establecer diferencias entre la composición proteica de los cuerpos densos en ambas líneas celulares. Por otro lado, se realizará un estudio proteómico más exhaustivo utilizando la técnica SWATH que nos permite conocer que proteínas y en qué cantidad tenemos en cada una de nuestras muestras.
Los aislados purificados y enriquecidos en CMV serán sometidos a luz UV para inactivar los posibles ácidos nucleídos residuales tras lo cual serán inyectados en ratones BALB/C. Los sueros de estos ratones serán empleados para la realización tanto de ensayos de neutralización y de citotoxidad mediada por anticuerpos (ADCC) con el fin de determinar la capacidad de neutralizar la entrada del virus en células epiteliales ARPE-19.
Con esta metodología se pretende caracterizar el potencial que ofrecen los cuerpos densos producidos en células epiteliales como candidatos vacunales frente a CMV, solventando así un problema de salud pública global.