Ecology and Evolution of Antibiotic Resistance
Los sistemas de bombeo múltiple de drogas son elementos de expulsión de antibióticos cuya expresión, bajo condiciones de laboratorio, está estrictamente reprimida. Alguno de ellos, como AcrAB en E. coli, MexAB-OprM en P. aeruginosa o SmeDEF en S. maltophilia se expresan a bajo nivel y contribuyen a la resistencia intrínseca, pero en la mayor parte de los casos solo tienen un papel en la resistencia a los antibióticos cuando se sobre-expresan. A pesar de que estos sistemas se han estudiado de modo exhaustivo, se conoce muy poco sobre las condiciones o efectores que inducen su expresión. Nuestro interés es analizar posibles efectores de los sistemas de bombeo múltiple de drogas más relevantes en la resistencia de S. maltophilia (SmeDEF, SmeOP, SmeVWX y SmeYZ) y de P. aeruginosa (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN y MexXY). También se analizará la bomba AcrAB de E. coli como control y para buscar inhibidores de su expresión, como se describe a continuación.
Para realizar este análisis, los promotores de las distintas bombas se clocarán construcciones con reporteros fluorescentes y se analizarán los cambios de expresión en presencia de distintos efectores usando como primera aproximación phenotypic microarrays (Biolog). Estos arrays son placas de 96 pocillos, cada uno de los cuales contiene un compuesto, lo que permite analizar un gran número de efectores potenciales simultáneamente. Debido a que el compuesto se encuentra liofilizado en el fondo del pocillo, las placas se incubarán 2 horas en agitación a temperatura ambiente para permitir que el compuesto presente en cada pocillo se disuelva en el medio. Posteriormente 10 µl del correspondiente cultivo serán inoculados en cada pocillo a una DO600 final de 0,01. Las medidas de crecimiento y fluorescencia se realizarán durante 20 horas cada 10 minutos empleando el lector de placas Tecan Infinite 200 (TECAN) a una temperatura de 37°C.
En los casos en los que se detecten cambios en los niveles de expresión, dichos cambios se verificarán creciendo las estirpes silvestres (sin marcador fluorescente) en presencia del efector potencial y analizando los niveles de expresión de la bomba putativamente inducida mediante RT-PCR. Además de los efectores que induzcan la expresión de las diferentes bombas, prestaremos particular atención a compuestos que disminuyan los niveles de expresión de los sistemas MDR que contribuyen a la resistencia intrínseca: AcrAB en E. coli (y en general el Enterobacteriaceae), MexAB-OprM en P. aeruginosa y SmeDEF en S. maltophilia. Para verificar la significación biológica de los cambios observados, analizaremos la sensibilidad a los antibióticos conocidos que son expulsados por las bombas analizadas, en presencia y en ausencia de su efector potencial.